De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado conetanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) elcolorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
Objetivos
• Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos
• Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia del objetivo de inmersión)
• Conocer y manejar las unidades de medida de las células y establecer comparaciones entre tamaños de procariotas y de eucariotas
• Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.
Materiales
- Mechero Bunsen o de Alcohol
- Asa de Siembra o aguja enmangada
- Pinzas
- Portaobjetos
- Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro Dental, Suelo, etc.
- Palillos
- Microscopios
- Aceite de inmersión
- Soporte de Tinciones
- Goteros
- Pinzas
- Agua destilada
- Colorantes para Tinción: Solución de cristal Violeta Lugol Safranina Etanol 95%
Procedimiento
I. prepara las muestras siguiendo estos pasos:
1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una pequeña cantidad de yogur con ayuda de un palillo higiénico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental extraído de la boca de alguien.2. Prepara una fina extensión (frotis), en otros portas, dejándolos secar.3. Fija este frotis dándole varios pases a los portas sobre la llama del mechero, con la muestra hacia arriba.
II Tiñe ahora los frotis fijados mediante los siguientes pasos:
1. Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se retirará el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para non desprender la muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y después se realizará otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta.2. Se retirará el colorante con etanol, goteándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las células Gram- pierden el colorante violeta y quedarán incoloras. Las Gram + seguirían violeta.3. Añade una gota de agua a la preparación y cubre las preparaciones 2 min. con safranina (colorante de contraste).Finalmente, lava el colorante con agua. Este colorante sólo entrará en las bacterias Gram –, que quedarán rojas. Las Gram + seguirán violetas.
Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsérvalas con microscopio utilizando el objetivo de inmersión. En esta tinción diferencial las bacterias Gram – aparecen rojas y las Gram + violeta. Observar (100×). Lugol
Tinción negativa
1. colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjeto, colocar una gota de muestra2. realizar frótis, 3. dejar secar.
Resultados
Preguntas de análisis
1) Cuáles son las fuentes de errores más comunes de error en la Tinción de gram.
Los peores obstáculos de la Tinción, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del técnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la técnica. A continuación describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos de Tinción.
- Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.
- pH inadecuado.
- El colorante se fija a la célula por mecanismos físico-químicos, que se alteran si el Ph no es el apropiado.
- Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros.
- Tiempo de Tinción incorrecto.
- Temperatura suficiente.
2) Explique qué reacción de Gram darán las levaduras. Estos tendrán la misma importancia que para las bacterias.
El color depende de la composición de la pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda una clasificación por medio del gram lo que no sucede con las levaduras.
3) Explique el fundamento de la Tinción negativa realizada en la práctica. Qué tipo de información se obtiene.
La Tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La Tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
4) Investigue otra técnica de Tinción selectiva que permita observar otras estructuras bacterianas.
Las Tinciones Selectivas nos permiten observar estructuras de las células gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados.
5) ¿A qué se debe el distinto comportamiento de las bacterias según sean Gram+ o Gram-?
El distinto comportamiento en la Tinción se piensa que es debido a las diferentes capas superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos de Células).
6) ¿Para que se necesita el aceite de inmersión ?
El aceite de inmersión tiene un indice de refracción similar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.
Conclusión
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren mucho químicamente esta diferencia química es los que permite distinguir las bacterias por Tinción, pues generalmente, el colorante reacciona con la célula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.
Debido a eso la Tinción es importante para la microbiología debido a que:
- Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.
- Permite el estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana, tales como paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares.
- Permite el empleo de mayores amplificaciones.
